ライトシート顕微鏡 (SPIM)

従来の広視野顕微鏡や共焦点顕微鏡が試料全体を照射するのに対し、ライトシート顕微鏡は薄いレーザー光シートを用いて試料の単一面で蛍光を励起します。直交配置された第2の対物レンズが放出された蛍光を集光します。試料上でライトシートを走査することで、顕微鏡は3次元画像スタックを構築します。

構築された構造には、いくつかの大きな利点があります：

• 撮像面のみが照射されるため、光退色と光毒性が大幅に低減します。
• 点単位ではなく、面全体を同時に撮像するため高速な3D体積イメージングが可能です。
• 焦点外の蛍光を大幅に排除するため優れたS/N比を実現します。

簡単に言えばSPIM法は、穏やかに、高速で、深部まで観察できるまさに動き続ける生物のダイナミックな観察に最適なバランスを持ち合わせています。

バイオフォトニクス研究においてSPIMは生体を長期間にわたって研究する上で不可欠な存在となり、これまで光損傷や撮像深度の限界のために不可能だった知見を提供しています。

SPIM独自の利点は以下のとおりです：

• 光損傷と退色が最小限に抑えられる - 観察面のみが光に照射されます。
• バックグラウンドノイズが低減 - 撮像領域外は照明されないため。
• 高速画像取得 - 動的なプロセスの体積イメージングが可能。
• 高い光学セクショニング能力 - 鮮明な3D蛍光マップが得られます。
• 光学的に透明化された大型サンプルや生体サンプルにも対応可能です。

これらの利点によりライトシート顕微鏡は、従来の高強度レーザー走査顕微鏡では捉えきれない、胚全体、発達中の組織、オルガノイド、神経回路網などのイメージングに最適です。

レーザーはあらゆるライトシート顕微鏡の照明エンジンです。その高いビーム品質、安定性、そして波長可変性はイメージ品質とシステム性能を直接左右します。

SPIMレーザーに求められる主な要件は以下のとおりです：

• 均一で薄いライトシートを生成するための優れたビームポインティングと空間モード品質。
• 高い信号対雑音比の蛍光検出を実現するための低強度ノイズ（RIN）。
• 光損傷を防ぎ、再現性を確保するための、安定的かつ精密に制御された出力。
• 多様な蛍光色素やタンパク質に対応する複数の励起波長。
• コンパクトで信頼性の高いファイバー結合型構成により、容易なシステム構築と光学アライメントフリー操作を実現。

現代のライトシートシステムでは多くの場合、複数の蛍光色素分子をそれぞれ特定の励起波長で同時に、または順番に励起する必要があります。
TOPTICAのマルチカラーレーザーエンジンは紫色、可視、近赤外のダイオードレーザーを1つのコンパクトなモジュール型プラットフォームに統合します。

マルチカラーレーザーエンジンでは複数の独立したレーザーを使用する代わりに、すべての波長について以下の処理が行われます：

• 複数のビームを正確に結合し、単一の光出力を生成します。
• 顕微鏡に直接ファイバー結合することで、完璧な空間的オーバーラップを実現します。
• 一定出力と長期動作のために能動的に安定化されます。

この技術アプローチには、いくつかの重要な利点があります：

• 光学的な調整が簡素化され、すべてのレーザーラインが同軸かつ安定した状態を維持します。
• 波長間の高速切り替えにより、多色蛍光イメージングに最適です。
• 照明強度の安定化により、定量的なイメージングに不可欠です。
• 省スペース・コスト効率に優れ、1つのレーザーエンジンで複数の個別光源を代替できます。

1 つのレーザーエンジンで紫 (405 nm) から可視 (488、561、594 nm)、近赤外 (640～780 nm) までをカバーすることで、ユーザーはほぼすべての一般的な蛍光色素と蛍光タンパク質をカバーできます。

ファイバー結合は、信頼性と柔軟性に優れたSPIM操作の基盤となる技術です。
TOPTICAのシングルモード偏波保持ファイバー結合は以下のことを保証します。

• 最適なライトシート形成のための完璧なガウスビームプロファイル。
• 数ヶ月使用した後でも、再調整なしで長期間の安定性を実現。
• 市販およびカスタム顕微鏡システムへのプラグアンドプレイ接続。

COOL ACテクノロジーとアクティブ温度・出力安定化機能を組み合わせることで、TOPTICAのレーザーエンジンは長期にわたるイメージング実験において真のハンズオフ操作を実現します。研究者はレーザーのメンテナンスに煩わされることなく生物学的発見に集中できます。

共焦点顕微鏡や広視野顕微鏡と比較して、ライトシート顕微鏡は光損傷と光退色を大幅に低減し、生体システムの長期観察を可能にします。
照明が薄い面に限定されるため、

• 細胞試料は長時間の観察においても健全で活性な状態を維持します。
• 背景蛍光とノイズは最小限に抑えられます。
• 取得データ量が大幅に低減されるため、画像処理と解析が高速化されます。

光シート顕微鏡は現代生物学における最も刺激的な最先端領域のいくつかで画期的な知見を明らかにしてきました：

• ゼブラフィッシュとショウジョウバエの胚発生：生物学者たちは細胞の動きと遺伝子発現をリアルタイムで可視化し、発生初期における組織や器官の形成過程を明らかにしました（Keller et al., Science, 2008）。
• 透明マウスの脳マッピング：全脳光シートイメージングにより細胞レベル以下の解像度で神経細胞を完全に再構成することが可能になり、コネクトミクス研究が進展しました。
• オルガノイドとガン研究：増殖中のオルガノイドの長期イメージングにより、生理的条件下での腫瘍の進化、転移、薬剤反応に関する知見が得られました。
• 植物生物学：SPIMは、生きた植物における栄養輸送と根の成長を、これまでにない鮮明さで可視化するために用いられてきました。

これらの技術的ブレークスルーはある重要な事実を浮き彫りにしています。それは、動き続ける生命を理解するには、低エネルギーで3D体積測定可能なイメージング技術が不可欠であるということです。

ライトシート顕微鏡はバイオフォトニクスの真髄を体現しています。それは穏やかな光を用いて生体システムのダイナミクス、複雑さを探求することです。
マルチカラーレーザーエンジン、ファイバー結合による高精度、そして手間のかからない安定性を備えたTOPTICAのレーザーシステムは、生物科学者が生命現象をリアルタイムで観察、定量化し、理解することを完全にサポートします。

TOPTICA Photonics：
”生命の世界をひとつの平面で明らかにする光をお届けすることを約束します。”