ラベルフリー & 臨床向けイメージング

(ラマン, CARS)

生命科学と医学研究において光は生体システムの複雑さを理解する鍵となります。今日では、ラマン分光法、CARS法、SRS法、OCT法、SHG法といった高度なレーザーイメージング技術により、科学者や臨床医は色素や造影剤を用いることなく分子構造情報を可視化することが可能です。このいわゆるラベルフリーイメージングは​​、組織、細胞、生体分子の本来の生化学的組成と形態を明らかにし、最小限のサンプル調製と光毒性なしにリアルタイムの知見を提供します。

ラベルフリー光学イメージングの原理

Raman spectroscopy and Raman microscopy

ラマンイメージングは​​光子の非弾性散乱（ラマン効果）を利用しています。ラマン効果では、光のごく一部が分子の振動と相互作用しエネルギーが変化します。各分子には固有のラマン指紋があり、正確な化学識別を可能にします。ラマン顕微鏡法はレーザーを生物学的サンプル上に焦点を合わせ、これらの変化を検出することでタンパク質、脂質、核酸などの生体分子の空間分布をマッピングします。
→ 一般的なレーザー：サンプルの蛍光と透過のニーズに応じて、405 nm、532 nm、633 nm、785 nm、または1064 nmの連続波半導体レーザーまたは固体レーザーが利用できます。

Autofluorescence microscopy

Autofluorescence microscopy harnesses the intrinsic fluorescence of biological tissues to enable label-free imaging. Endogenous molecules such as NADH, flavins, collagen, and elastin emit light when excited at specific wavelengths, revealing tissue structure, metabolic activity, and biochemical composition without the need for external dyes. This minimally invasive approach preserves native biological conditions while delivering high-contrast images.

Two-photon autofluorescence microscopy

Two-photon autofluorescence microscopy extends these capabilities by using two-photon excitation with ultrafast near-infrared laser pulses. Here, fluorescence is generated only when two low-energy photons are absorbed simultaneously at the focal point. This localized excitation enables deeper tissue penetration, intrinsic three-dimensional resolution, and reduced photodamage—making it ideal for high-resolution imaging of thick samples or even in-vivo.

→ Typical lasers: Femtosecond fiber lasers at 780, 920 or 1050 nm

第二高調波発生イメージング (SHG法)

第二高調波発生イメージング(SHG法)は2つの光子が正確に2倍の周波数（波長の半分）で1つの光子に結合する非線形光学相互作用を利用します。このプロセスは、コラーゲン、ミオシン、微小管などの中心対称性を持たない構造において自然に発生し、染色することなく結合組織や細胞骨格構造を高コントラストで可視化することを可能にします。
→ 代表的なレーザー：フェムト秒ファイバーレーザー（約780 nmまたは約1030 nm）。

Fluorescence lifetime imaging (FLIM)

D. Santos, Uni Ulm, GerBi workshop

Two-photon fluorescence lifetime imaging (FLIM) can provide insights beyond standard fluorescence microscopy and non-linear microscopy by analyzing fluorescence decay times. In addition, FLIM can be used as a label-free, autofluorescence technique and is therefore non-invasive. For example, simultaneous NADH and FAD decay measurements provide insight into the metabolic state of biological samples.

A fast electronic trigger output from femtosecond fiber lasers serves as a reference for time-correlated single photon counting (TCSPC) electronics in fluorescence lifetime imaging (FLIM) and gated detectors.

→ Typical lasers: Femtosecond fiber lasers at 780, 920 or 1050 nm

Multimodal imaging

Multimodal imaging integrates diverse technological modalities within a unified microscopy platform, thereby facilitating a more comprehensive examination of biological specimens. In a multimodal approach, for instance, signals from molecules such as NADH, FAD, collagen, and elastin are collected simultaneously by two-photon autofluorescence, SHG, and confocal imaging methods. This combination enables researchers to correlate morphological features with functional and metabolic insights in real time.

Multimodal imaging has been demonstrated to maximize information content while minimizing sample preparation and photodamage, thus rendering it a powerful tool for studying complex biological systems, living tissues, and dynamic processes under near-physiological conditions.

Example: conventional H&E histology versus cross-modal microscopy combining pinhole-free reflectance confocal microscopy (pf-RCM), second harmonic generation (SHG), two-photon autofluorescence, short (2PS) and two-photon autofluorescence, long (2PL). Taken from: Montgomery, et al., Handheld multiphoton and pinhole-free reflectance confocal microscopy enables noninvasive, real-time cross-sectional imaging in skin; Nature (2024)

ラベルフリーイメージングが重要な理由

従来の蛍光法や免疫組織化学法とは異なり、ラベルフリーイメージングには次のような利点があります。

  • 本来の生物学的環境が維持され、染色、タグ、固定アーティファクトは不要です。
  • 光毒性なしに生細胞または生体内での長期イメージングが可能です。
  • 化学的特異性と構造コントラストを同時に提供します。
  • 臨床現場におけるリアルタイム診断と定量的生化学分析を容易にします。

これらの利点により、ラベルフリー光イメージングは​​バイオフォトニクス分野において最も有望な分野の一つであり、基礎研究と医療診断の橋渡し役として活躍しています。

研究から実社会​​への応用まで

Example of handheld scanner incorporating TOPTICA's FemtoFiber smart 780 PT. Taken from: Montgomery, et al., Handheld multiphoton and pinhole-free reflectance confocal microscopy enables noninvasive, real-time cross-sectional imaging in skin; Nature (2024)

Until recently, the complexity and cost of traditional ultrafast laser systems limited two-photon microscopy to specialized research labs. Fiber-based femtosecond lasers are changing that paradigm — combining turnkey operation and robustness suitable for clinical and translational environments.

This simplification is paving the way for clinical-grade two-photon imaging systems in dermatology, ophthalmology, histology and endoscopy. The new generation of compact, fiber-coupled femtosecond lasers brings the promise of two-photon microscopy from the research bench to the clinical applications.

 

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