ラベルフリー & 臨床向けイメージング

(ラマン, CARS)

生命科学と医学研究において光は生体システムの複雑さを理解する鍵となります。今日では、ラマン分光法、CARS法、SRS法、OCT法、SHG法といった高度なレーザーイメージング技術により、科学者や臨床医は色素や造影剤を用いることなく分子構造情報を可視化することが可能です。このいわゆるラベルフリーイメージングは​​、組織、細胞、生体分子の本来の生化学的組成と形態を明らかにし、最小限のサンプル調製と光毒性なしにリアルタイムの知見を提供します。

ラベルフリー光学イメージングの原理

ラマン分光 & ラマン顕微法

ラマンイメージングは​​光子の非弾性散乱（ラマン効果）を利用しています。ラマン効果では、光のごく一部が分子の振動と相互作用しエネルギーが変化します。各分子には固有のラマン指紋があり、正確な化学識別を可能にします。ラマン顕微鏡法はレーザーを生物学的サンプル上に焦点を合わせ、これらの変化を検出することでタンパク質、脂質、核酸などの生体分子の空間分布をマッピングします。


→ 一般的なレーザー：サンプルの蛍光と透過のニーズに応じて、405 nm、532 nm、633 nm、785 nm、または1064 nmの連続波半導体レーザーまたは固体レーザーが利用できます。

自家蛍光顕微鏡法

自家蛍光顕微鏡法（Autofluorescence microscopy）は、生体組織が本来持つ固有の蛍光を利用して、標識（ラベル）を必要としないイメージングを可能にする技術です。NADH、フラビン、コラーゲン、エラスチンなどの内因性分子は、特定の波長の光で励起されると蛍光を発し、外部の蛍光色素を使用することなく、組織の構造、代謝活性、および生化学的組成に関する情報を提供します。この低侵襲な手法は、生体本来の状態を維持しながら、高コントラストな画像を取得できるという利点があります。

二光子自家蛍光顕微鏡法

二光子自家蛍光顕微鏡法（Two-photon autofluorescence microscopy）は、超短パルス近赤外レーザーによる二光子励起を利用することで、自家蛍光顕微鏡法の能力をさらに拡張した技術です。この手法では、2個の低エネルギー光子が焦点位置で同時に吸収された場合にのみ蛍光が発生します。

この局所的な励起により、組織深部への高い到達性、三次元的な空間分解能、および光損傷の低減が実現されます。そのため、厚みのある試料や生体内（in vivo）試料の高分解能イメージングに特に適しています。

→ 一般的に使用されるレーザー

  • 780 nm 920 nm 1050 nm フェムト秒ファイバーレーザー

第二高調波発生イメージング (SHG法)

第二高調波発生イメージング(SHG法)は2つの光子が正確に2倍の周波数（波長の半分）で1つの光子に結合する非線形光学相互作用を利用します。このプロセスは、コラーゲン、ミオシン、微小管などの中心対称性を持たない構造において自然に発生し、染色することなく結合組織や細胞骨格構造を高コントラストで可視化することを可能にします。
→ 代表的なレーザー：フェムト秒ファイバーレーザー（約780 nmまたは約1030 nm）。

Fluorescence lifetime imaging (FLIM)

D. Santos, Uni Ulm, GerBi workshop

蛍光寿命イメージング（FLIM：Fluorescence Lifetime Imaging）は、蛍光の減衰時間（蛍光寿命）を解析することにより、従来の蛍光顕微鏡法や非線形顕微鏡法では得られない情報を提供することができます。また、FLIMは自家蛍光を利用したラベルフリー技術としても利用可能であり、非侵襲的な測定が可能です。例えば、NADHとFADの蛍光寿命を同時に測定することで、生体試料の代謝状態に関する有益な情報を得ることができます。

フェムト秒ファイバーレーザーから出力される高速電子トリガー信号は、蛍光寿命イメージング（FLIM）やゲート型検出器に用いられる時間相関単一光子計数（TCSPC：Time-Correlated Single Photon Counting）システムの基準信号として利用されます。

→ 一般的に使用されるレーザー

  • 780 nm 　920 nm　1050 nm フェムト秒ファイバーレーザー

多元イメージング

マルチモーダルイメージングは、複数の異なるイメージング技術を単一の顕微鏡プラットフォーム上に統合することで、生体試料をより包括的に解析することを可能にします。例えば、二光子自家蛍光イメージング、SHG（第二高調波発生）イメージング、および共焦点イメージングを組み合わせることで、NADH、FAD、コラーゲン、エラスチンなどの分子由来の信号を同時に取得できます。このような組み合わせにより、研究者は組織や細胞の形態学的特徴と機能的・代謝的情報をリアルタイムで関連付けて解析することができます。

マルチモーダルイメージングは、試料調製の負担や光損傷を最小限に抑えながら、取得できる情報量を最大化できることが示されています。そのため、複雑な生体システム、生体組織、さらには生理的条件に近い環境下で進行する動的プロセスの研究において、非常に強力なツールとなっています。

例： 従来のH&E（ヘマトキシリン・エオシン）染色による組織学的観察と、ピンホールレス反射型共焦点顕微鏡（pf-RCM）、第二高調波発生（SHG）、短波長側の二光子自家蛍光（2PS）、および長波長側の二光子自家蛍光（2PL）を組み合わせたクロスモーダル顕微鏡法との比較。 こちらから引用: Montgomery, et al., Handheld multiphoton and pinhole-free reflectance confocal microscopy enables noninvasive, real-time cross-sectional imaging in skin; Nature (2024)

ラベルフリーイメージングが重要な理由

従来の蛍光法や免疫組織化学法とは異なり、ラベルフリーイメージングには次のような利点があります。

  • 本来の生物学的環境が維持され、染色、タグ、固定アーティファクトは不要です。
  • 光毒性なしに生細胞または生体内での長期イメージングが可能です。
  • 化学的特異性と構造コントラストを同時に提供します。
  • 臨床現場におけるリアルタイム診断と定量的生化学分析を容易にします。

これらの利点により、ラベルフリー光イメージングは​​バイオフォトニクス分野において最も有望な分野の一つであり、基礎研究と医療診断の橋渡し役として活躍しています。

研究から実社会​​への応用まで

TOPTICA社の FemtoFiber smart 780 PT を搭載したハンドヘルドスキャナーの例。こちらから引用: Montgomery, et al., Handheld multiphoton and pinhole-free reflectance confocal microscopy enables noninvasive, real-time cross-sectional imaging in skin; Nature (2024)

これまで、従来型の超短パルスレーザーシステムは複雑で高価であったため、二光子顕微鏡は主に専門的な研究施設に限られていました。しかし、ファイバーベースのフェムト秒レーザーの登場により、この状況は大きく変わりつつあります。これらのレーザーは、ターンキー操作（容易な立ち上げ・運用）と高い堅牢性を兼ね備え、臨床現場やトランスレーショナルリサーチ（橋渡し研究）に適した環境での利用を可能にしています。

この技術の簡素化により、皮膚科、眼科、病理組織学、内視鏡分野における臨床グレードの二光子イメージングシステムの実現が加速しています。コンパクトでファイバー結合型の次世代フェムト秒レーザーは、二光子顕微鏡を研究室の実験装置から実際の臨床応用へと展開する可能性をもたらしています。

 

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