共焦点顕微鏡
共焦点レーザースキャニング顕微鏡 (CLSM or LSCM) – 高解像度でバイオロジーを観る。
生きた世界を照らす
共焦点レーザー走査顕微鏡（CLSM）は、研究者がサブミクロンの精度で生物学的構造を3次元的に可視化することを可能にし、生命科学イメージングに革命をもたらしました。レーザー光を回折限界のスポットに集光し、焦点外の光を除去することで、CLSMは組織、細胞、細胞小器官の鮮明で高コントラストな画像を提供します。広視野顕微鏡と比較して、CLSMは優れた光学セクショニングとコントラストを提供し、横方向分解能はわずかに向上します。
神経科学や細胞生物学から臨床診断に至るまで、共焦点顕微鏡はバイオフォトニクス研究の礎となっています。そして、あらゆる共焦点システムの成功の鍵となるのが、レーザー光源です。
原理: 光による光学セクショニング
広視野蛍光顕微鏡のようにカメラを使用する代わりに、CLSMは、集光されたレーザースポットを標本上で走査し、高感度PMT/GaAsP検出器を備えたピンホール開口部を通して放出された蛍光を検出することで機能します。画像のピクセルは、2次元スキャンの連続記録点から構成されます。
主に焦点面からの光が検出器に到達し、焦点外の光はピンホールによって大きく減衰されます。これにより、光学セクショニング機能を備えた非常に鮮明な画像が作成されます。これらの断面をZ軸に沿って積み重ねることで、顕微鏡は生物試料の真の3次元画像を再構成します。
実際には、異なる波長の複数のレーザーが、特定の細胞構造に結合した蛍光色素またはタンパク質を連続的に励起します。放出された光はスペクトル的に分離され、記録されます。これにより、生体システムにおける分子、細胞小器官、組織の複雑な相互作用を明らかにする多色画像が得られます。
なぜ共焦点顕微鏡は魅力的なのか？
共焦点顕微鏡は、以下の機能を備えているため、現代の生命科学研究に欠かせないツールとなっています：
- 高解像度での生細胞および組織の3Dイメージング
- 分子動態およびタンパク質局在を解析するための定量的蛍光分析
- 物理的なスライスを必要としない非破壊光学セクショニング
- 複数の生物学的標的を同時に観察するための多色イメージング
これらの機能により、以下の分野における発見が可能になります。
- 細胞シグナル伝達と輸送
- 神経ネットワークマッピング
- がんおよび幹細胞研究
- 創薬と薬理学
- 発生生物学と遺伝学
蛍光の宇宙を励起する
蛍光イメージングは、それぞれ励起波長と発光波長が定められた特定の色素とフローフォアに依存します。
以下に、最も一般的に使用される蛍光体とその励起波長をいくつか示します。複数のレーザーラインが不可欠である理由を示しています。
| 色素 / フローフォア | 励起波長 |
|---|---|
| BFP, DAPI, Hoechst | 405 nm |
| CFP, Alexa Fluor 430 | 445 nm |
| GFP, FITC, Alexa Fluor 488 | 488 nm |
| YFP, Cy3, TRITC, Oregon Green | 515 nm / 520 nm |
| RFP, Cy5, Alexa 555/561 tdTomato, DsRed, mOrange | 561 nm |
| Alexa Fluor 594, Halorhodopsin, MitoTracker, MitoFluor Red 594 | 594 nm |
| Cy5, Alexa Fluor 647, BODIPY | 640 nm |
| Cy7 | 730 nm |
| IRDye 800CW, iFluor™ 780, Indocyanine green (ICG) | 780 nm |
最先端のライフサイエンスラボでは、1 回のイメージング セッションで 4 ～ 7 種類の励起波長が必要になることが多く、ここでマルチレーザーソリューションが大きな違いを生み出します。
マルチな波長 – ひとつの光源で, ひとつのファイバーで実現する
TOPTICAのマルチレーザーエンジンは、紫色、可視、近赤外のダイオードレーザーを単一の柔軟なプラットフォームに統合します。複数の大型レーザーモジュールを使用する代わりに、すべての波長がシングルビーム結合され、1本の光ファイバーを介して顕微鏡にファイバー結合されます。
この統合により、いくつかの明確な利点が得られます。
- すべてのレーザーライン間の完璧な空間アライメント - 毎日の調整は不要です。
- 各色間のシームレスな切り替えは、高速マルチチャンネルイメージングに最適です。
- COOL ACテクノロジーにより、ファイバー結合パワーを長期にわたって一定に保ち、ハンズオフ操作で長期安定性を実現します。
- コンパクトでメンテナンスフリーの設計は、市販の顕微鏡やカスタム顕微鏡に簡単に統合できます。
研究者は、安定した照明、再現性の高い観察結果、ダウンタイムの短縮といったメリットを享受でき、煩わしいレーザーのメンテナンスは過去のものとなります。
直接変調半導体レーザーの優位性
共焦点顕微鏡において最も重要な性能の一つはタイミング時間制御、すなわち走査システムや検出回路と完全に同期した状態で、レーザーラインのオン/オフをマイクロ秒単位で切り替える能力です。
TOPTICAのダイオードレーザー技術は、レーザー電流の直接変調を可能にし、外部変調器なしでマイクロ秒単位のスイッチングを実現します。
これにはFDDL（第二高調波発生ダイオードレーザー）技術によって実現される、困難な561nm波長も含まれます。
AOM または AOTF 変調器を備えた固体レーザーに対する優位点
-
応答速度の向上 - 各波長の光源でマイクロ秒単位の直接変調を実現します。
-
波長間のクロストークなし - AOTF（音響光学可変フィルター）は、レーザーライン間の不要なパワーカップリングを引き起こす可能性があります。
-
より堅牢なセットアップ - 外部変調器やRFドライバーは不要です。
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効率の向上と温度ドリフトの低減 - 長期安定性の向上につながります。
実用的には、これは特に複雑なマルチレーザー共焦点システムにおいて、よりクリーンな励起光源、より優れたマルチカラー波長制御、そしてより高い測定精度を意味します。
AOTFを用いた際のレーザーライン間のクロストークを示します。1つまたは複数のアクティブ化されたラインが、他の不必要なレーザーラインを「透過」させます。
iChrome システムのすべてのレーザーラインは完全に独立しています。
レーザーライン間のクロストークはありません。
低ノイズ – 高感度
共焦点顕微鏡では、微弱な蛍光や光退色によって信号強度が制限されることがよくあります。
低ノイズレーザー光源は、優れた信号対雑音比（SNR）、より鮮明な画像、光退色の低減、そして単一分子やシナプス小胞といった微細構造の検出能力に直接つながります。
TOPTICA社のレーザーの特徴：
- 極めて低い相対強度ノイズ（RIN）
- 優れたビームポインティング安定性
- 全波長域にわたる高速変調とデジタルブランキング
これにより、長時間のタイムラプス実験や深部組織実験においても、すべての光子が確実に制御され利用可能です。
ファイバー結合の完璧さ
共焦点システムにおける安定性と柔軟性には、ファイバーカップリングが不可欠です。TOPTICA社のシングルモード偏波保持ファイバーカップリングにより、研究者は以下のメリットを得られます。
- 試料面における均一な照明プロファイル
- 光学アライメントの手間を軽減 - プラグアンドプレイで使用可能
- 顕微鏡外部へのレーザー設置による熱および振動の分離向上
- 高いファイバーカップリング効率と長期信頼性
COOL ACとアクティブ温度制御を組み合わせることで、数ヶ月にわたる連続運転後でも、一定の出力とビーム品質を維持します。
つまり、光学系を一切気にすることなく、本来の研究に集中できるのです。
新発見の限界をさらに拡げる
共焦点顕微鏡は、過去30年間で数え切れないほどの科学的ブレークスルーを可能にしてきました。
レーザーベースの共焦点イメージングが科学の進路を変えた例をいくつかご紹介します。
- 神経科学：マウス脳内の生きた神経回路のイメージングにより、シナプス可塑性が学習と記憶の基盤となっていることが明らかになりました（Ziv & Smith, Neuron 1996）。
- がん研究：蛍光標識された腫瘍細胞の共焦点イメージングにより、転移が細胞-マトリックス相互作用によって誘導される仕組みが実証され、新たな治療標的の発見につながりました。
- 細胞生物学：ミトコンドリアの動態をリアルタイムで観察することで、健常細胞と病変細胞において、エネルギー代謝とアポトーシスが密接に関連していることが解明されました。
- 発生生物学：蛍光胚の3Dイメージングにより、遺伝子発現勾配が組織形態形成を導く仕組みが示されました。これはシステム生物学における画期的な成果です。