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荧光寿命成像

测量分子激发寿命

荧光寿命成像显微镜(FLIM)是一种基于测量标记染料或研究材料本身光致发光(PL)衰减时间的显微镜技术。在吸收光子之后,荧光分子将维持在激发态,直到通过释放光子或通过非辐射过程(淬灭,能量转换)回到基态。这个时间对于特定材料(在恒定的环境条件下)是一种本征性质,因此即便在光谱重叠严重的情况下也可用来区分荧光信号。

荧光寿命受发光材料附近的化学环境影响十分强烈。因此通过测量荧光寿命,可以获得本地pH值,氧气含量,或离子浓度等参数,以及电荷转移动力学特性等。

FLIM通常基于激光扫描显微镜与时间相关单光子计数(TCSPC)电子器件的组合。通过多次重复利用脉冲激光逐像素扫描样品,光子计数器件将记录光子的到达时间,测量激发脉冲和荧光光子之间的时间差。记录直方图的包络函数包含光致发光衰减的瞬态信息。利用一级或多级指数函数模拟,该瞬态信息可在利用仪器响应函数(IRF)处理数据之后用于提取仪器的影响。

通过这种拟合,在每个像素上可按照信号强度平均提取相应荧光寿命。所得结果是样本的彩色编码图像。FLIM通过结合共聚焦/双光子显微镜的三维分辨率与时间分辨测量,为样品提供完备的四维信息。

TOPTICA提供各种飞秒和皮秒激光系统,它们的脉冲长度短,波长范围广,非常适合FLIM的应用。