二次谐波(SHG)显微镜

用于SHG显微镜/二次谐波成像显微镜的超快激光

在二次谐波产生(SHG)过程中,通过双光子与非线性材料的相互作用可以产生能量为入射光两倍,波长为入射光一半的新光子。该现象于1961年在石英晶体中首次被发现,而仅仅几年后,该现象就被应用于研究生物样本。从那以后,二次谐波成像显微镜(SHIM)已逐渐发展为细胞和相关组织结构及功能视觉化的标准方法。该技术通过使用飞秒和皮秒锁模长波(近红外以及红外)激发增强光学分辨率并减小光学损伤。激光缩小了有效激发体积并且增加了穿透深度,使得光学分辨率得以提高。

在双光子显微镜中,激发二次谐波的概率非常低,它取决于照明光强度的平方。因此,仅仅在激发交点处,光强才足以使得非线性效应发生。由于在较低平均激发能量之下可以产生足够高的光强,锁模超快激光是该应用的理想光源,在保护样品材料不受损害的同时产生所需非线性效应。

与传统荧光显微镜不同,二次谐波和三次谐波显微镜不需要样品标记。这意味着不需要用荧光染料来标记目标结构,从而样品的分子结构不会受到影响,同时它的代谢情况也不会改变。这些特点使得双倍频显微镜成为相关应用的理想工具,尤其是对活细胞成像。

然而,二次谐波产生(SHG)需要非中心对称分子结构,而且只有非常有序的结构才能够为SHG提供足够高的作用截面。在生物组织中,能够产生足够强SHG信号用于成像的主要是胶原蛋白(一种细胞外蛋白),微管和肌球蛋白(细胞内蛋白)。SHG显微镜可应用于例如活肌肉细胞中的肌球蛋白非侵入高分辨率成像或细胞外基质结构变化的分析等方向。

SHG 成像系统 最常见的设置是配备有锁模皮秒或飞秒脉冲激光源的激光扫描显微镜(LSM),波长一般处于近红外,红外,直到中红外区域。在LSM中,输入激光束通过高数值孔径的物镜耦合入样品中。显微镜中的扫描镜改变光束的方向,使焦点横向扫描样品。这样可以通过逐个像素扫描获得2D图像。通过改变显微镜载物台或显微镜的轴向位置,可获取不同焦平面的图像,用于3D成像。或者将激发激光束保持在样品平面,通过压电扫描单元移动样品使得光焦点在其上光栅式扫描。

如前所述,SHG信号可在光束传播正向或反向得到探测。反射SHG信号由扫描镜退扫描并由适合的双色镜反射至光电倍增管(PMT)或雪崩二极管(APD)得以探测。而正向SHG信号将光用另一个目镜聚焦,使焦点与照明目镜焦点以及非退扫描PMT重合,通过透射光进行检测。在上述两种成像方法中,激光通过短通滤波器与PMT隔开。为了保证自发荧光信号不会干扰探测,可在光路中另加一个针对激光波长一半的窄带滤波器。

TOPTICA’s 到目前为止SHG成像主要依靠体积大且造价昂贵的钛蓝宝石激光器。TOPTICA的FemtoFiber超快光纤激光 为您提供各种基于光纤的超快一站式激光系统,适用于所有先进显微镜技术。